檸檬黃-過(guò)氧化物酶標(biāo)記物的制備方法主要有以下幾種：

過(guò)碘酸鈉法

• 原理：辣根過(guò)氧化物酶（HRP）的糖基用過(guò)碘酸鈉氧化成醛基，加入抗體IgG后該醛基與IgG氨基結(jié)合，形成Schiff氏堿。為了防止HRP中糖的醛基與其自身蛋白氨基發(fā)生偶合，在用過(guò)碘酸鈉氧化前先用二硝基氟苯阻斷氨基。氧化反應(yīng)末了，用硼氫化na穩(wěn)定Schiff氏堿。

• 操作步驟：

• 將5mg HRP溶于0.5ml 0.1mol/L NaHCO3溶液中；加0.5ml 10mmol/L NaIO4溶液，混勻，蓋緊瓶塞，室溫避光作用2小時(shí)。

• 加0.75ml 0.1mol/L Na2CO3混勻。

• 加入0.75ml小鼠已處理的腹水，或純化單抗等（15mg/ml），混勻。

• 稱取Sephadex G25干粉0.3g，加入一支下口墊玻璃棉的5ml注射器外筒內(nèi)；隨后將上述交聯(lián)物移入注射器外套；蓋緊，室溫作用（避光）3小時(shí)或4℃過(guò)夜。

• 用少許PBS將交聯(lián)物全部洗出，收集洗出液，加1/20V體積新鮮配制的5mg/ml NaBH4溶液，混勻，室溫作用30分鐘；再加入3/20V NaBH4溶液，混勻，室溫作用1小時(shí)（或4℃過(guò)夜）。

• 將交聯(lián)物過(guò)Sephadex G200或Sepharose 6B（2.6×50cm）層析純化，分管收集。

改良過(guò)碘酸鹽氧化法

• 原理：通過(guò)過(guò)碘酸鹽氧化HRP，使其產(chǎn)生醛基，然后與檸檬黃特異性抗體的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的標(biāo)記物。

• 操作步驟：

• 溶解5mg HRP于1ml超純水中，加入新配制的0.1mol/L多碘酸鈉75μL，置室溫或4℃冰箱反應(yīng)20分鐘或30分鐘。

• 反應(yīng)完后裝入透析袋，0.001mol/L pH＝4.0醋酸緩沖液4℃透析過(guò)夜，期間需要更換透析液幾次。

• 將抗體用0.01mol/L碳酸緩沖液稀釋至10mg/mL，另外用0.01mol/L碳酸緩沖液將活化好的HRP的溶液pH調(diào)至9.5。將0.5ml抗體加入HRP溶液中，置室溫或4℃冰箱反應(yīng)2小時(shí)。

• 加入100μL 4mg/mL硼氫化na，4℃冰箱反應(yīng)2小時(shí)。

• 對(duì)0.01mol/L PBS透析過(guò)夜，加入保存液-20℃保藏備用。

戊二醛法

• 原理：戊二醛作為雙功能交聯(lián)劑，能與HRP和抗體的氨基結(jié)合，形成穩(wěn)定的標(biāo)記物。

• 操作步驟：

• 將5mg AKP加入1ml抗體溶液（2mg/ml）中溶解，裝入透析袋，于4℃對(duì)0.01mol/L PH7.2 PBS透析18小時(shí)，換液三次。

• 加入2.5%戊二醛20ul，室溫作用1-2小時(shí)，4℃對(duì)PBS透析過(guò)夜，其間換液三次。

• 換用0.05mol/L PH8.0 Tris-HCl緩沖液透析，4℃過(guò)夜，換液三次。

• 取出標(biāo)記抗體，用含1%BSA的Tris-HCl緩沖液稀釋至4ml，即為AKP標(biāo)記物原液。

• 每毫升中加入0.4ml甘油，小量分裝，保存?zhèn)溆谩?/p>

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