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氨丙啉-過氧化物酶標(biāo)記物的制備方法有哪些

2025-04-13 [16]

氨丙啉-過氧化物酶標(biāo)記物的制備方法主要有以下幾種:

戊二醛二步法

  • 原理:戊二醛為一種雙功能試劑,通過其醛基分別與酶和免疫球蛋白上的氨基共價結(jié)合,形成酶-戊二醛-抗體結(jié)合物。

  • 步驟

    • 取一定量的過氧化物酶(如辣根過氧化物酶,HRP),用0.1M的PBS(pH6.8)溶解,配制成一定濃度的酶溶液。

    • 向酶溶液中加入適量的戊二醛,使其終濃度為0.05% - 0.1%,室溫下攪拌反應(yīng)1 - 2小時。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的戊二醛。

    • 取一定量的氨丙啉,用0.1M的PBS(pH7.2)溶解,配制成一定濃度的氨丙啉溶液。

    • 將上述處理后的酶溶液與氨丙啉溶液混合,室溫下攪拌反應(yīng)2 - 4小時。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的氨丙啉,得到氨丙啉-過氧化物酶標(biāo)記物。

過碘酸鈉法

  • 原理:過碘酸鈉可將HRP分子表面的糖鏈氧化,形成醛基,再與氨丙啉上的氨基結(jié)合,形成標(biāo)記物。

  • 步驟

    • 取一定量的HRP,用0.1M的PBS(pH6.8)溶解,配制成一定濃度的酶溶液。

    • 向酶溶液中加入適量的過碘酸鈉,使其終濃度為0.05% - 0.1%,室溫下攪拌反應(yīng)30 - 60分鐘。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的過碘酸鈉。

    • 取一定量的氨丙啉,用0.1M的PBS(pH7.2)溶解,配制成一定濃度的氨丙啉溶液。

    • 將上述處理后的酶溶液與氨丙啉溶液混合,室溫下攪拌反應(yīng)2 - 4小時。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的氨丙啉,得到氨丙啉-過氧化物酶標(biāo)記物。

碳二亞胺法

  • 原理:碳二亞胺可活化HRP分子上的羧基,使其與氨丙啉上的氨基形成酰胺鍵,從而實現(xiàn)標(biāo)記。

  • 步驟

    • 取一定量的HRP,用0.1M的PBS(pH6.8)溶解,配制成一定濃度的酶溶液。

    • 向酶溶液中加入適量的碳二亞胺(如EDC),使其終濃度為0.05% - 0.1%,室溫下攪拌反應(yīng)1 - 2小時。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的碳二亞胺。

    • 取一定量的氨丙啉,用0.1M的PBS(pH7.2)溶解,配制成一定濃度的氨丙啉溶液。

    • 將上述處理后的酶溶液與氨丙啉溶液混合,室溫下攪拌反應(yīng)2 - 4小時。

    • 反應(yīng)結(jié)束后,用PBS透析或超濾除去未反應(yīng)的氨丙啉,得到氨丙啉-過氧化物酶標(biāo)記物。

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